Kokenut petolintuharrastaja voi tuntea retkeilyalueensa haukat – vähän kuin omat taskunsa. Todetaan, että pesivä naaras vaikutti samalta kuin viime vuonna, koska se oli niin vaalea tai iso, tai sillä oli poikkeuksellinen ääni tai se oli huomattavan aggressiivinen jne. Kuitenkin tunnistamisesta jää usein vahva epäilys. Tunnistaminen ulkoisista tekijöistä vaatisi pitempiaikaista seurantaa. Kanahaukka luultavasti tunnistaa puolisonsa matkan päästä, mutta ihmiselle haukan yksilöllinen tunnistaminen on kutakuinkin mahdotonta. Samalla moni mielenkiintoinen populaatioekologinen seikka jää hämärän peittoon. Pesikö tämä naaras viime vuonna tosiaan naapurireviirillä? Onko naapurireviirien haukat sukua toisilleen? Hakeutuvatko jälkeläiset pesimään emolintujen lähelle? Onko kyseessä alfa-naaras, joka vetää muita haukkoja pesimään naapurireviireille? Jos alfa-naaras siirtyy muualle, lähtevätkö vanhat naapurit mukaan vai miksi syntyy aukkoja pesintäverkkoon hyville riistamaille?
Kanahaukoilla yksilöiden luotettava tunnistaminen vaatii DNA-testausta. DNA-testit kehittyvät huimaa vauhtia kohti kustannustehokkaampia, luotettavampia, nopeampia ja standardisoituja menetelmiä. Nykyään DNA-testaus on yksi modernin biologian, lääketieteen ja luonnonsuojelun tärkeimmistä työkaluista. Se on antanut populaatioekologeille runsaasti uutta ajateltavaa. Esim. on paljastunut, että jalohaukat ovat enemmän sukua papukaijoille kuin kanahaukoille!
 |
https://en.wikipedia.org/wiki/DNA_sequencing |
Käsitykseni mukaan kanahaukkojen DNA-sekvenssointia on tehty jossain määrin. Joka tapauksessa kanahaukan sekä kromosomaalinen että mitokondrionaalinen DNA on selvitetty. Näytteet on kerätty yleensä pesäpoikasilta tai pyydystetyiltä aikuisilta, joko verinäytteestä tai nypityistä höyhenistä. Varsinkin aikuispyynti on kuitenkin haastavaa. Se voi aiheuttaa linnulle stressiä ja loukkaantumisriski on suuri.
 |
https://en.wikipedia.org/wiki/DNA_sequencing |
Mutta tähän on kevyempi ratkaisu: DNA:n selvitys jättösulista. Kanahaukkanaaraat alkavat sulkia haudonnan alettua. Sulkasadossa pudotettujen sulkien löytäminen pesäpaikoilta on helppoa ja voidaan suorittaa pesintää häiritsemättä. Itseltänikin saattaisi löytyä jotain materiaalia 50 vuoden ajalta 700:lta pesältä. Sulista voisi kartoittaa kanahaukkojen yksilötiedot ja sukulaisuussuhteet tutkimusalueella. Näytteiden keräys ei ole ongelma. Tarvitaan vain sopiva laboratorio ja menetelmäkokemusta omaavat laborantit. Kaikenlaista mielenkiintoista tutkittavaa löytyy varmasti muutaman lopputyön ja väitöskirjan varran kuvatunlaisestakin ongelmakentästä.
Ohessa jonkinlaisena tiiserinä referoitu Ineta Kalninan & all tutkimus, jossa selvitettiin ja kuvattiin menetelmä kanahaukan DNA-seksensointiin.
Kaikki tästä eteenpäin viittaa yo. raporttiin [*0], ellei muuta mainittu.
Abstrakti
Tausta/tavoitteet : Tässä tutkimuksessa [*0] arvioitu sulkasadon saaneiden kanahaukan höyhenten soveltuvuutta DNA:n lähteenä koko genomin uudelleensekvensointiin.
Menetelmät : Analysoitu 75 sulkasadon käynyttä sulkaa, jotka oli kerätty lisääntymisalueilta. Sulat mitattiin ja niiden kunto arvioitiin silmämääräisesti. Koko genomin uudelleensekvensointi suoritettiin 13-kertaisella tavoitepeittävyydellä käyttäen 150 emäsparin pariluettuja sekvenssejä (paired-end reads).
Tulokset : Sulkanäytteet suoriutuivat keskimäärin hyvin ja tuottivat 208,7 ± 59,82 miljoonaa sekvenssilukemaa, joista 82,69 ± 27,15 % oli linjassa referenssigenomin kanssa, jolloin 83,58 ± 19,02 % genomista käsiteltiin ainakin kerran. Laatusuodatuksen jälkeen jäljellä oli 10,34 ± 3,11 miljoonaa kaksialleelista yksinukleotidivarianttia, joista 457 745 oli yleisiä variantteja (MAF > 0,05). Suuremmat, hyväkuntoiset sulkanäytteet, joista DNA:n saanto oli suurempi, suoriutuivat yleensä paremmin koko uudelleensekvensoinnin työnkulun ajan. Siitä huolimatta noin 22,7 % näytteistä epäonnistui heikon genotyypin laadun ja puutteiden vuoksi.
Johtopäätökset : Suorituskyky vaihteli huomattavasti jopa samanlaisten ominaisuuksien omaavien näytteiden välillä, mikä osoittaa, että parempi näytteenvalinta, jossa otetaan huomioon isäntä-DNA:n laadun suorat mittaukset, voi olla hyödyllistä. Näistä haasteista huolimatta sulkasatoiset sulkanäytteet ovat helposti saatavilla oleva DNA-lähde keskikokoisten ja suurten petolintulajien koko genomin uudelleensekvensointiin.
1. Johdanto
Kenttäkokeiden täydentäminen geneettisten työkalujen avulla villieläintutkimuksessa voi tarjota muuten saavuttamattomissa olevaa tietoa populaatiorakenteesta, väestöhistoriasta, populaation pitkäaikaisesta kunnosta, muuttoreiteistä ja jopa erilaisista käyttäytymiseen liittyvistä näkökohdista sekä näkemyksiä ympäristöhaasteisiin sopeutumisesta. Geneettinen analyysi vaatii kuitenkin biologisen materiaalin, perinteisesti veri- ja kudosnäytteiden, keräämistä, joista saadaan korkealaatuista DNA:ta, mikä edellyttää yksittäisten eläinten pyydystämistä. Lajista riippuen tällaiset menetelmät voivat aiheuttaa merkittävää stressiä ja kohtuutonta häiriötä, mikä voi johtaa käyttäytymisen muutoksiin ja lisääntyneeseen loukkaantumisriskiin sekä eläimille että tutkijoille. Siksi yhä useammat lintulajeihin keskittyvät tutkimukset siirtyvät käyttämään sulkasadossa poistettuja sulkia, ulosteita tai munankuoria geneettisen materiaalin lähteenä. Tällöin näytteenotto välttää suoraa kosketusta lintuihin ja voi olla vähemmän vaativaa teknisen koulutuksen kannalta, helpompi toteuttaa, vähemmän aikaa vievää tai joissakin tapauksissa ainoa mahdollinen vaihtoehto. Jättösulat ovat luultavasti yleisimmin käytetty ulkoinen DNA-lähde, joka tarjoaa arvokasta geneettistä tietoa populaatioiden monimuotoisuutta ja kokoa, sukupuolisuhteita, käyttäytymisekologiaa, muuttoreittejä, merkintä-uudelleenpyynti -analyysejä ja muita luonnonsuojelun kannalta elintärkeitä näkökohtia koskeviin tutkimuksiin.
Eurasian kanahaukka (Astur gentilis) keskikokoinen petolintu. Useat geneettiset tutkimukset ovat käyttäneet sulittuja sulkia linnun yksilöintiin ja populaatiorakenteen selvittelyyn euraasialaisilla ja amerikkalaisilla kanahaukoilla.
Tässä esitellään jättösulista peräisin olevan DNA:n soveltuvuutta koko genomin sekvensoinnissa (WGS) käyttäen pesintäpaikoilta ( A. gentilis ) kerättyjä sulkanäytteitä. Menetelmä on epäilemättä hyödyllinen lajeilla, joita on vaikea pyydystää esimerkiksi verinäytteen ottamiseksi.
2. Materiaalit ja menetelmät
2.1. DNA-näytteen kerääminen ja käsittely
Kanahaukan irtosulkia kerättiin kahden pesimäkauden aikana (2020–2021, maaliskuusta elokuuhun) 60 tunnetulta kanahaukan pesimäreviiriltä. Näistä 36 reviiriä sijaitsi Riian kaupunkiympäristössä ja 24 eri puolilla Latviaa. Tapauksissa, joissa samalta alueelta kerättiin useampi kuin yksi sulka, valittiin yksi näyte koko genomin sekvensointia varten sulan yleisen fyysisen kunnon perusteella.
Erä sulkanäytteitä säilytettiin huoneenlämmössä, toinen erä -20 °C:ssa DNA:n uuttamiseen asti. Näytteet esikäsiteltiin suunnitellun menetelmän mukaisesti. DNA:n eristys suoritettiin QIAamp DNA Mini Kit -pakkauksella (Qiagen, Hilden, Saksa) noudattaen käyttäjän kehittämää protokollaa, joka suunniteltu DNA:n eristämiseen kynsistä, hiuksista tai höyhenistä. Lyhyesti sanottuna näytteitä inkuboitiin 20–24 tuntia 56 °C:ssa jatkuvasti ravistellen liuoksessa, joka sisälsi ATL-puskuria, proteinaasi K:ta ja DTT:tä. AL-puskurin lisäämisen jälkeen näytteitä inkuboitiin 70 °C:ssa 45 minuuttia, minkä jälkeen ne sentrifugoitiin roskien poistamiseksi.
Seuraavaksi lisättiin 96-prosenttista etanolia ja näytteet ladattiin silikapylväisiin ja pestiin valmistajan ohjeiden mukaisesti. DNA eluoitiin AE-puskuriin 70 °C:ssa, 15 minuutin inkuboinnin jälkeen. DNA-näytteiden laatu arvioitiin 1,2-prosenttisella agaroosigeelielektroforeesilla ja Qubit 2.0 -fluorometrillä käyttäen Qubit dsDNA HS Assay Kit -pakkausta. DNA:n puhtaus mitattiin NanoDrop ND-1000 -spektrofotometrillä. DNA:n fragmentoitumista arvioitiin retrospektiivisesti käyttämällä Genomic DNA ScreenTape –määritystä.
2.2. WGS-analyysi
WGS-analyysiä varten valittiin 75 sulkasadon saanutta sulkaa, yhteensä 281:sta populaatiotutkimuksia varten kerätystä näytteestä. Näistä DNA-näytteistä valmistettiin kirjastot käyttämällä MGIEasy Universal DNA Library Prep Set -sarjaa valmistajan ohjeiden mukaisesti. Viivakoodikirjastot yhdistettiin, yhdistetyt kirjastot ringealisoitiin ja sekvensoitiin DNBSEQ-G400RS High-throughput Sequencing Set –sarjalla.
2.3. Sekvensointi, tietojenkäsittely ja tilastollinen analyysi
Raakasekvensointilukemien alustava laadunvalvonta suoritettiin, adapterit poistettiin ja arvot laatutarkistettiin. A gentilis genomireferenssi indeksoitiin käyttäen bwa-indeksialgoritmia, ja indeksoitu sekvenssisanakirja luotiin. Raakalukemat kohdistettiin indeksoituun referenssigenomiin käyttämällä BWA-MEM-algoritmia. Kohdistetut lukemat muunnettiin BAM-muotoon. Lisäkäsittely, mukaan lukien mate-pair-tietojen päivittäminen, inserttien koon laskeminen, duplikaattien merkitseminen ja sekvensointisyvyyden arviointi suoritettiin. Kartoitustilastot saatiin BAM-tiedostoista käyttämällä siihen soveltuvia ohjelmistoja.
Kartoittamattomilla kontiguilla sekä Z- ja W-kromosomeilla sijaitsevat variantit ja kaikki muut kuin kaksialleeliset variantit poistettiin, jolloin autosomeihin jäivät vain kaksialleeliset yhden nukleotidin variantit (SNV). Näille kaksialleelisille SNV:ille tehtiin edelleen tiukka suodatus. GATK:n PLINK v2.0 KING -robustia sukulaisuusestimaattoria käytettiin mahdollisten kaksoiskappaleiden tunnistamiseen. Genotyypin konkordanssi kaksoiskappaleiden välillä arvioitiin bcftools v.1.21 gtcheck -funktiolla, ja virhe- ja konkordanssiprosentit laskettiin jakamalla yhteensopimattomuudet tai vastaavuudet vertailtujen paikkojen kokonaismäärällä.
2.4. Tilastollinen analyysi
Tilastollinen analyysi ja datan visualisointi suoritettiin RStudio v.4.4.1:ssä . Jatkuvien muuttujien välisiä yhteyksiä arvioitiin Spearmanin järjestyskorrelaatiotestillä ja eri ryhmien välisiä keskiarvoja verrattiin Mann-Whitney U -testillä .
3. Tulokset
Koko genomin sekvensointiin valitut jättösulat olivat pituudeltaan 40–313 mm, keskipituuden ollessa 199 mm, mikä heijastaa suurempien siipi- ja pyrstösulkien yliedustusta. Visuaalisen arvioinnin perusteella 60 % sulista luokiteltiin hyväkuntoisiksi, 36 % kohtalaiseksi ja 4 % huonokuntoisiksi, tietoa sulkien ominaisuuksista, DNA:n laadusta ja koko genomin sekvensointituloksista on esitetty taulukoissa S1 ja S3 [*0] .
3.1. DNA:n saanto näytteistä
Saanto sulkien osalta oli keskimäärin noin 7,2 ng/μl, mutta vaihteli huomattavasti näytteiden välillä. Suuremmat, pääasiassa pyrstö- ja lentosulat, tuottivat suurempia DNA-määriä kuin pienemmät vartalosulat. On huomionarvoista, että kohtalaisen kunnollisten sulkien DNA-saanto oli suurempi kuin hyväkuntoisten, 5,2 ng/μl verrattuna 10,9 ng/μl:aan. Kohtalaisen kuntoiset sulat olivat kuitenkin myös, vaikkakin ei-merkitsevästi, suurempia kuin hyväkuntoiset, mikä on saattanut vaikuttaa DNA-saantoon. Kolme huonokuntoista sulkaa tuottivat 1,58 ng/μl - 3,35 ng/μl DNA:ta. Huoneenlämmössä ja −20 °C:ssa säilytettyjen sulkien välillä ei havaittu merkittäviä eroja DNA-saannossa. Analyysin rajaaminen kaupunkialueilta kerättyihin sulkiin antoi saman tuloksen. Vastaavasti sulkien keräysalueella ("kaupunki" vs. "maaseutu") ei ollut merkittävää vaikutusta DNA-saantoon.
NanoDrop ND-1000 -spektrofotometrillä mitatut DNA-pitoisuudet olivat keskimäärin seitsemän kertaa korkeammat kuin Qubit 2.0 -fluorometrillä mitatut pitoisuudet. TapeStation-järjestelmällä 30 näytteen osajoukosta arvioitu keskimääräinen DNA-fragmentin koko oli 2513 bp ja vaihteli 500:sta 12 905 bp:hen.
3.2. Sulista saatujen näytteiden WGS-suorituskyky
DNA:n menetys ei korreloinut sulkien koon, havaittavien verihyytymien esiintymisen, kirjaston valmisteluun käytettävissä olevan DNA:n määrän tai keskimääräisen DNA-fragmentin koon kanssa.
Sulkien raakasekvensointilukumäärät vaihtelivat 8,02:sta 310,7 miljoonaan, keskimäärin se oli 213,0 miljoonaa. Keskimäärin 0,25 pmol kirjastoa tuotti 247,7 miljoonaa raaka-arvoa näytettä kohden sulkien ominaisuuksista riippumatta.
Kohdistukseen käytettyjen arvojen määrä vaihteli 7,7 miljoonasta 300,5 miljoonaan, keskimäärin 208,7 miljoonaan. Kaiken kaikkiaan sekvensointilukujen kartoituksen onnistumisprosentti kanahaukan genomiin oli korkea 82,7 %.
Yleisesti ottaen suuremmat sulat suoriutuivat paremmin lukukartoituksen suhteen.
3.3. SNV-osumat (calls?) sulista johdetuissa näytteissä
Saavutettu sekvensointisyvyys ja genomin kattavuus tuottivat autosomeissa yhteensä 130,72 miljoonaa suodattamatonta kaksialleelista yksinukleotidivarianttia (SNV).
Yhteensopivien (called?) varianttien laatu suodatettiin, jotta saatiin joukko, joka mahdollisesti soveltuisi jatkoanalyyseihin. Paikkakohtaisen varianttien suodatuksen ensimmäinen vaihe oli GATK-suositusten mukainen tiukka suodatus, jossa poistettiin keskimäärin 5,46 % SNV:stä näytettä kohden. Suurin osa SNV:stä kuitenkin menetettiin, kun poistettiin heikkolaatuiset variantit, joille tyypillistä oli alhainen GQ, riittämätön DP tai korkea genotyypin puuttuminen näytteistä. Tämä vaihe selitti 94,2 %:n poiston kaikista laatusuodattimia rikkoneista paikoista.
Lopullinen SNV-määrä koko otosjoukossa oli 11,95 miljoonaa, vaikka heikosti suoriutuneissa otoksissa oli vain 5723 SNV:tä.
Näytejoukon kaksoiskappaleiden tarkistus tunnisti kuusi sulkaparia ja yhden kolmen kappaleen, jotka edustivat yhteensä seitsemää eri yksilöä. Sukulaisuusanalyysin avulla samalle yksilölle osoitetut sulkanäytteet kerättiin joko samalta reviiriltä (viisi kaksoiskappaleparia) tai naapurialueelta (kaksi kaksoiskappaleparia), mikä on yhdenmukaista sukulaisuusanalyysin kanssa. Tämä mahdollisti genotyypin konkordanssin arvioinnin biologisten replikaattien välillä. Kaikissa vertailluissa paikoissa arvioitu keskimääräinen genotyypin virheprosentti oli 0,16 %, vaihdellen 0,018 %:sta 0,38 %:iin.
Koska huonolaatuiset ja paljon puuttuvia genotyyppejä sisältävät näytteet voivat vääristää populaatiogeneettisiä päätelmiä, tällaiset näytteet suljettiin pois
Lopullisissa 58 näytteessä oli 9,82–11,95 miljoonaa laatusuodatettua SNV:tä näytettä kohden. Frekvanssisuodatuksen avulla lopulliseen VCF-tiedostoon löytyi 472 493 yleistä SNV:tä (MAF > 0,05), joissa oli 382 854–472 228 SNV:tä näytettä kohden. Alleelifrekvenssejä on kuitenkin saatettu aliarvioida epätasaisen genomikattavuuden vuoksi sulkasadon jälkeen kerätyissä näytteissä.
4. Keskustelu
Keskikokoisten ja suurten petolintujen, kuten kanahaukkojen, jättösulat ovat helpoimmin saatavilla olevia näytteitä, joita voidaan kerätä turvallisesti aikuisilta yksilöiltä ilman pyydystämiseen liittyviä riskejä, erityisesti populaation seurantaa varten. Huolimatta DNA:n laatuun liittyvistä ongelmista, jotka ovat yleisiä erityyppisten ei-invasiivisten näytteiden joukossa, jättösulkia on käytetty onnistuneesti DNA-lähteenä tiedon saamiseksi populaatiogenetiikasta useilla eri lintulajeilla. Tehdyt tutkimukset ovat osoittaneet jättösulkien kiistattoman arvon DNA:n lähteenä, mutta myös korostaneet puutteita, jotka on tiedostettava luotettavien johtopäätösten tekemiseksi.
Esimerkiksi juuri pudonneet varislintujen siipisulat tuottivat keskimäärin 64,8 ng/µl - 519,5 ng/µl DNA:ta lajin koosta riippuen, kun taas kahden kuukauden ulkona olleiden hanhen höyhenten DNA-pitoisuus oli keskimäärin 22,8 ng/µl [ viite 20* ].
Kaiken kaikkiaan sulkasadon saaneet sulkanäytteet suoriutuivat verrattain hyvin, sillä keskimäärin 83,8 % luennoista kartoitti kanahaukan genomin ja 83,6 % genomista oli käsitelty ainakin kerran. Tuoreeltaan kerätyillä varpuslintulajin höyhenillä kartoitusasteet vaihtelivat 85,9 %:n ja 90,0 %:n välillä, ja 66 % genomista saatiin talteen [ 51 ].
DNA:n hajoaminen ei kuitenkaan todennäköisesti ollut ainoa tekijä, joka vaaransi WGS-tuloksia sulista peräisin olevissa näytteissä. Isännän genomin palautumisen vaihtelut ovat suurelta osin johtuneet eksogeenisestä DNA-pitoisuudesta. Esimerkiksi keskimäärin noin 60 % irtokarvanäytteistä peräisin olevista lukemista oli eksogeenistä.
Vaihtelut voivat kuitenkin liittyä myös mikro-organismien läsnäoloon.
Kaiken kaikkiaan 22,7 %:n sulkanäytteistä katsottiin epäonnistuneiksi mahdollisten genotyypitysvirheiden ja suuren puuttuvan tiedon osuuden vuoksi. Koko genomin kattavissa tutkimuksissa ulostenäytteiden epäonnistumisaste oli noin 21 %, kun taas karvapyyntivälineistä kerättyjen irronneiden karvojen epäonnistumisaste oli jopa 75 %.
Vaikka kohtalaisen kuntoiset sulat muistuttivat lukulaadun mittareiden perusteella hyväkuntoisia, sulkien kunnolla näytti olevan vahvempi yhteys genotyypin laatuun kuin kokoon. Sulkien kuntoon liittyvät erot säilyivät myös heikkolaatuisten varianttien poistamisen jälkeen, kun taas laatusuodatus eliminoi suurelta osin kokoon liittyvät erot.
Lopullinen joukko sulkasadon jälkeen kerättyjä sulkanäytteitä, tuotti yhteensä 12 miljoonaa laatusuodatettua kaksialleelista SNV:tä, joista valtaosa oli harvinaisia variantteja. Koko aineistosta vain 455 149 SNV:tä oli yleisiä (MAF > 0,05), mikä on huomattavasti vähemmän kuin tuoreista varpuslintujen höyhenistä raportoidut.
5. Johtopäätökset
Ei-invasiivisesti kerätyistä kanahaukan ( A. gentilis ) sulkasadon hyväkuntoiset suuret lento- ja pyrstösulat, olivat parempi DNA-lähde ja toimivat luotettavammin koko genomin sekvensointiprosesseissa. Havaittu näytteen epäonnistumisprosentti osoittaa, että ylijäämämateriaalin kerääminen olisi edullista genomianalyysien onnistumisprosentin parantamiseksi. Joistakin mahdollisista rajoituksista huolimatta tuloksemme tukevat jättösulkien käyttöä pätevänä ja helposti saatavilla olevana DNA-lähteenä keskikokoisten ja suurten petolintulajien koko genomin laajuisissa uudelleensekvensointitutkimuksissa, vaikka käytettäisiin koko genomin sekvensointiprotokollia ilman erityisiä säätöjä.
Käsitteet
Ei-invasiivinen Ei tunkeudu kehon sisälle, ei riko ihoa tai limakalvoja (esim. ei verikoe, ei ihosta nypitty höyhen)
Lyhenteet
Dokumentissa käytetään seuraavia lyhenteitä:
SNP Yhden nukleotidin polymorfismi
WGS-koodi Koko genomin sekvensointi
SNV Yksittäisten nukleotidien variantit
FS Fisher Strand
SOR Strandin kerroinsuhde
MQ RMS-kartoituksen laatu
MQRankSum Laadun kartoituksen järjestyssummatesti
QD Laatu syvyyden mukaan
DP-koodi Syvyys näytettä kohden
GQ Genotyypin laatu
PCA Pääkomponenttianalyysi
Tutkimuksessa käytettiin vain ei-invasiivisesti kerättyjä näytteitä. Eläimiä ei pyydystetty tai käsitelty, eikä eettistä lisähyväksyntää vaadittu.
Viitteet
*0. Ineta Kalnina, Ance Roga, Dita Gudra, Edgars Liepa, Otars Opermanis, Imants Jakovlevs, Janis Klovins, Davids Fridmanis. Applicability of Non-Invasively Collected Eurasian Goshawk (Astur gentilis) Moulted Feathers for Whole Genome Sequencing Analysis. Genes 2026, 17(2), 193; https://doi.org/10.3390/genes17020193. Latvian Biomedical Research and Study Centre, Latvian Ornithological Society (LOB).
1.Carroll EL, Bruford MW, DeWoody JA, Leroy G., Strand A., Waits L., Wang J. Geneettinen ja genominen seuranta minimaalisesti invasiivisilla näytteenottomenetelmillä. Evol. Appl. 2018;11:1094–1119. doi: 10.1111/eva.12600. [ DOI ] [ PMC-vapaasti saatavilla oleva artikkeli ] [ PubMed ] [ Google Scholar ]
2.Bounas A., Tsaparis D., Gustin M., Mikulic K., Sarà M., Kotoulas G., Sotiropoulos K. Geneettisten markkereiden käyttö lintujen alkuperän selvittämiseen muuttopaikkoja edeltävinä aikoina. Sci. Rep. 2018;8:8326. doi: 10.1038/s41598-018-26669-x. [ DOI ] [ PMC-vapaasti saatavilla oleva artikkeli ] [ PubMed ] [ Google Scholar ]
3.Duntsch L., Whibley A., Brekke P., Ewen JG, Santure AW:n eri resoluutioiden genomitiedot paljastavat johdonmukaisia sisäsiittoisuusarvioita, mutta ristiriitaisia homotsygoottisuusmaisemia uhanalaisella Aotearoa Uuden-Seelannin Hihi-lajilla. Mol. Ecol. 2021;30:6006–6020. doi: 10.1111/mec.16068. [ DOI ] [ PubMed ] [ Google Scholar ]
4.Geraldes A., Askelson KK, Nikelski E., Doyle FI, Harrower WL, Winker K., Irwin DE Populaatiogenomiset analyysit paljastavat erittäin erilaistuneen ja uhanalaisen pohjoisen goshawkin (Accipiter gentilis laingi) geneettisen klusterin Haida Gwaissa. Evol. Appl. 2019; 12:757–772. doi: 10.1111/eva.12754. [ DOI ] [ PMC : n ilmainen artikkeli ] [ PubMed ] [ Google Scholar ]
5.Kersten O., Star B., Leigh DM, Anker-Nilssen T., Strøm H., Danielsen J., Descamps S., Erikstad KE, Fitzsimmons MG, Fort J., ym. Atlantin lunnin monimutkainen populaatiorakenne paljastui koko genomin analyyseillä. Commun. Biol. 2021;4:922. doi: 10.1038/s42003-021-02415-4. [ DOI ] [ PMC-vapaasti saatavilla oleva artikkeli ] [ PubMed ] [ Google Scholar ]
6.Ramón-Laca A., White DJ, Weir JT, Robertson HA DNA:n eristäminen vankeudessa pyydetyistä ulosteista ja sulkasuojista höyhenistä tarjoaa uuden menetelmän uudenseelantilaisten kiivien (Apteryx spp.) suojelun hallintaan. Ecol. Evol. 2018;8:3119–3130. doi: 10.1002/ece3.3795. [ DOI ] [ PMC-vapaasti saatavilla oleva artikkeli ] [ PubMed ] [ Google Scholar ]
7.Vallant S., Niederstätter H., Berger B., Lentner R., Parson W. Metson (Tetrao urogallus) ja teeren (Tetrao tetrix) ulosteiden ja höyhenten lisääntynyt DNA-tyypityksen onnistuminen. Ecol. Evol. 2018;8:3941–3951. doi: 10.1002/ece3.3951. [ DOI ] [ PMC-vapaasti saatavilla oleva artikkeli ] [ PubMed ] [ Google Scholar ]
8.Rudnick JA, Katzner TE, Bragin EA, Dewoody JA. Keski-Aasian ei-invasiivinen geneettinen arviointi ei-pesimättömien itäisten keisarikotkien (Aquila heliaca) populaatiokoosta, syntymäfilosofiasta ja orsimiskäyttäytymisestä. Conserv. Genet. 2008;9:667–676. doi: 10.1007/s10592-007-9397-9. [ DOI ] [ Google Scholar ]
9.Dawson DA, Kleven O., dos Remedios N., Horsburgh GJ, Kroglund RT, Santos T., Hewitt CRA. Moniosainen mikrosatelliittisarja kalasääsken (Pandion haliaetus) ei-invasiiviseen genotyypitykseen ja sukupuolen määritykseen. Conserv. Genet. Resour. 2015;7:887–894. doi: 10.1007/s12686-015-0497-4. [ DOI ] [ PMC-vapaasti saatavilla oleva artikkeli ] [ PubMed ] [ Google Scholar ]
10.Khan A., Patel K., Bhattacharjee S., Sharma S., Chugani AN, Sivaraman K., Hosawad V., Sahu YK, Reddy GV, Ramakrishnan U. Ovatko irronneiden hiusten genomit tehokkain ei-invasiivinen resurssi sukulaisuussuhteiden arvioimiseen luonnossa? Ecol. Evol. 2020;10:4583–4594. doi: 10.1002/ece3.6157. [ DOI ] [ PMC-vapaasti saatavilla oleva artikkeli ] [ PubMed ] [ Google Scholar ]
11.Zemanova MA Ei-invasiivinen geneettinen arviointi on tehokas villieläintutkimuksen työkalu verrattuna muihin lähestymistapoihin. Genes. 2021;12:1672. doi: 10.3390/genes12111672. [ DOI ] [ PMC-vapaasti saatavilla oleva artikkeli ] [ PubMed ] [ Google Scholar ]
12.Fu Y., Zhuang Y., Luo SJ, Xu X. Parannettu menetelmä matelijoiden ihon irtokappaleiden käyttämiseksi korkealaatuisena DNA-lähteenä genomisekvensoinnissa. Genes. 2023;14:1678. doi: 10.3390/genes14091678. [ DOI ] [ PMC-vapaa artikkeli ] [ PubMed ] [ Google Scholar ]
13.Dai Y., Lin Q., Fang W., Zhou X., Chen X. Ei-invasiivinen ja ei-tuhoava näytteenotto lintujen mikrosatelliittigenotyypitystä varten: tapaustutkimus haavoittuvasta kiinanhaikarasta (Egretta eulophotes) Avian Res. 2015;6:24. doi: 10.1186/s40657-015-0034-x. [ DOI ] [ Google Scholar ]
14.Peters C., Nelson H., Rusk B., Muir A. Uusi menetelmä alikäytettyjen sulkasadon saaneiden sulkanäytteiden hyödyllisyyden optimoimiseksi geneettisessä analyysissä lintujen suojelussa. Conserv. Genet. Resour. 2020;12:457–467. doi: 10.1007/s12686-019-01117-8. [ DOI ] [ Google Scholar ]
15.Presti FT, Meyer J., Antas PTZ, Guedes NMR, Miyaki CY Ei-invasiivinen geneettinen näytteenotto hyasinttiaran (Anodorhynchus hyacinthinus) molekyyliseksimääritykseksi ja mikrosatelliittigenotyypitykseksi. Genet. Mol. Biol. 2013;36:129–133. doi: 10.1590/S1415-47572013005000001. [ DOI ] [ PMC-vapaasti saatavilla oleva artikkeli ] [ PubMed ] [ Google Scholar ]
16.Hogan FE, Cooke R., Burridge CP, Norman JA. Irronneiden höyhenten käytön optimointi geneettisessä analyysissä. Mol. Ecol. Resour. 2008;8:561–567. doi: 10.1111/j.1471-8286.2007.02044.x. [ DOI ] [ PubMed ] [ Google Scholar ]
17.Vili N., Nemesházi E., Kovács S., Horváth M., Kalmár L., Szabó K. Tekijät, jotka vaikuttavat DNA:n laatuun ei-invasiiviseen näytteenottoon käytetyissä höyhenissä. J. Ornithol. 2013; 154:587–595. doi: 10.1007/s10336-013-0932-9. [ DOI ] [ Google Scholar ]
18.Segelbacher G. Ei-invasiivinen geneettinen analyysi linnuilla: Höyhennäytteiden luotettavuuden testaus. Mol. Ecol. Notes. 2002;2:367–369. doi: 10.1046/j.1471-8286.2002.00180.x-i2. [ DOI ] [ Google Scholar ]
19.de Volo SB, Reynolds RT, Topinka JR, May B., Antolin MF Population Genetics and Genotyping for Mark-Recapture Studies of Northern Goshawks (Accipiter gentilis) Kaibabin tasangolla, Arizonassa. J. Raptor Res. 2005;39:286–295. [ Google Scholar ]
20.González-Olvera M., Hernandez-Colina A., Chantrey J., Allen S., Lopez J., Baylis M. Ei-invasiivinen höyhenpohjainen menetelmä veriloisten (Haemosporida) havaitsemiseksi Sci. Rep. 2023;13:16712. doi: 10.1038/s41598-023-43932-y. [ DOI ] [ PMC-vapaasti saatavilla oleva artikkeli ] [ PubMed ] [ Google Scholar ]
21.Taylor RS, Manseau M., Redquest B., Keobouasone S., Gagné P., Martineau C., Wilson PJ Koko genomin sekvenssit ei-invasiivisesti kerätyistä karibujen ulostenäytteistä. Conserv. Genet. Resour. 2022;14:53–68. doi: 10.1007/s12686-021-01235-2. [ DOI ] [ Google Scholar ]
22.Sittenthaler M., Schöll EM, Leeb C., Haring E., Parz-Gollner R., Hackländer K. Lauhkean Keski-Euroopan saukon (Lutra lutra) ulosteiden genotyypityksen onnistumiseen ja genotyypityksen virheprosenttiin vaikuttavat tekijät. Eur. J. Wildl. Res. 2021;67:2. doi: 10.1007/s10344-020-01444-4. [ DOI ] [ Google Scholar ]
23.Graham CF, Glenn TC, McArthur AG, Boreham DR, Kieran T., Lance S., Manzon RG, Martino JA, Pierson T., Rogers SM ym. Hajotetun DNA:n vaikutukset restriktioentsyymeihin liittyvään DNA-sekvensointiin (RADSeq) Mol. Ecol. Resour. 2015;15:1304–1315. doi: 10.1111/1755-0998.12404. [ DOI ] [ PubMed ] [ Google Scholar ]
24.Arantes LS, Caccavo JA, Sullivan JK, Sparmann S., Mbedi S., Höner OP, Mazzoni CJ RADseq-menetelmien skaalaus suurille ei-invasiivisten näytteiden tietojoukoille: opetuksia kirjastojen rakentamiseen ja datan esikäsittelyyn. Mol. Ecol. Resour. 2025;25:e13859. doi: 10.1111/1755-0998.13859. [ DOI ] [ PMC-vapaasti saatavilla oleva artikkeli ] [ PubMed ] [ Google Scholar ]
25.Balmori-de la Puente A., Escoda L., Fernández-González Á., Menéndez-Pérez D., González-Esteban J., Castresana J. Ei-invasiivisten hiusnäytteiden ja ddRAD:n käytön arviointi uhanalaisten lajien populaatioiden karakterisoimiseksi: Sovellus Euroopan perifeeriseen populaatioon. Ecol. Evol. 2023;13:e10530. doi: 10.1002/ece3.10530. [ DOI ] [ PMC : n ilmainen artikkeli ] [ PubMed ] [ Google Scholar ]
26.Uno R., Kondo M., Yuasa T., Yamauchi K., Tsuruga H., Tamate HB, Yoneda M. Genotyypityksen tarkkuuden arviointi ei-invasiivisessa DNA-pohjaisessa populaatiotutkimuksessa aasialaisilla mustilla karhuilla (Ursus thibetanus): Oppitunteja laajamittaisesta pilottitutkimuksesta Iwaten prefektuurissa Pohjois-Japanissa. Popul. Ecol. 2012;54:509–519. doi: 10.1007/s10144-012-0328-3. [ DOI ] [ Google Scholar ]
27.McNulty SN, Mann PR, Robinson JA, Duncavage EJ, Pfeifer JD DNA-syötteen vähentämisen vaikutus seuraavan sukupolven sekvensointikirjaston monimutkaisuuteen ja varianttien havaitsemiseen. J. Mol. Diagn. 2020;22:720–727. doi: 10.1016/j.jmoldx.2020.02.003. [ DOI ] [ PubMed ] [ Google Scholar ]
28.McDonough MM, Parker LD, McInerney NR, Campana MG, Maldonado JE Yleisesti pyydettyjen destruktiivisten museonäytteiden käyttö nisäkkäiden genomitutkimuksissa. J. Mammal. 2018;99:789–802. doi: 10.1093/jmammal/gyy080. [ DOI ] [ Google Scholar ]
29.Turcu MC, Paștiu AI, Bel LV, Pusta DL Höyhenten ja suunäytteiden vertailu DNA-lähteinä seuralintujen molekyyliseksi sukupuolen määritykseksi. Animals. 2023;13:525. doi: 10.3390/ani13030525. [ DOI ] [ PMC-vapaasti saatavilla oleva artikkeli ] [ PubMed ] [ Google Scholar ]
30.Johansson MP, Mcmahon BJ, Höglund J., Segelbacher G. Monilokusgenotyyppien monistuskyky kentältä löydetyistä höyhenistä verrattuna ammutuista linnuista saatuihin höyheniin. Ibis. 2011;154:15–20. doi: 10.1111/j.1474-919X.2011.01194.x. [ DOI ] [ Google Scholar ]
31.Gebhardt KJ, Brightsmith D., Powell G., Waits LP. Perussa savikiekkojen sulkasuojista löydetyt höyhenet tarjoavat DNA:ta kolmelle isolle aralle (Ara ararauna, A. chloropterus ja A. macao). J. Field Ornithol. 2009;80:183–192. doi: 10.1111/j.1557-9263.2009.00221.x. [ DOI ] [ Google Scholar ]
32.Horváth MB, Martínez-Cruz B., Negro JJ, Kalmár L., Godoy JA Unohdettu DNA-lähde lintujen ei-invasiivisessa geneettisessä analyysissä. J. Avian Biol. 2004;36:84–88. doi: 10.1111/j.0908-8857.2005.03370.x. [ DOI ] [ Google Scholar ]
33.de Volo SB, Reynolds RT, Douglas MR, Antolin MF Parannettu uuttomenetelmä DNA:n saannon lisäämiseksi sullottuista höyhenistä. Condor. 2008;110:762–766. doi: 10.1525/cond.2008.8586. [ DOI ] [ Google Scholar ]
34.Speller CF, Nicholas GP, Yang DY Höyhenpiikit hyvänä mitokondriaalisen DNA:n lähteenä lintulajien tunnistamisessa rikosteknisissä villieläintutkimuksissa. Investig. Genet. 2011;2:16. doi: 10.1186/2041-2223-2-16. [ DOI ] [ PMC-vapaasti saatavilla oleva artikkeli ] [ PubMed ] [ Google Scholar ]
35.Hoy SR, Ball RE, Lambin X., Whitfield DP, Marquiss M. Geneettiset markkerit validoivat irronneiden höyhenten luonnollisten fenotyyppisten ominaisuuksien käyttöä yksittäisten pohjoisen kanahaukkojen (Accipiter gentilis) tunnistamiseksi. J. Avian Biol. 2016;47:443–447. doi: 10.1111/jav.00794. [ DOI ] [ Google Scholar ]
36.Andrews S. FastQC: Laadunvalvontatyökalu suuren läpimenon sekvenssitiedoille. [(luettu 30. elokuuta 2023)]. Saatavilla verkossa: http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/
37.Martin M. Cutadapt poistaa sovitinsekvenssit suuren läpimenon sekvensointilukemista. EMBnet. J. 2011;17:10–12. doi: 10.14806/ej.17.1.200. [ DOI ] [ Google Scholar ]
38.Bolger AM, Lohse M., Usadel B. Trimmomatic: Joustava trimmeri Illumina-sekvenssitiedoille. Bioinformatics. 2014;30:2114–2120. doi: 10.1093/bioinformatics/btu170. [ DOI ] [ PMC-vapaasti saatavilla oleva artikkeli ] [ PubMed ] [ Google Scholar ]
39.August K., Davison M., Bortoluzzi C. Pohjois-kanahaukan, Accipiter gentilis (Linnaeus, 1758), genomin sekvenssi. Wellcome Open Res. 2022;7:122. doi: 10.12688/wellcomeopenres.17821.1. [ DOI ] [ PMC-vapaa artikkeli ] [ PubMed ] [ Google Scholar ]
40.Li H., Durbin R. Nopea ja tarkka lyhyen lukutavan kohdistus Burrows-Wheeler-muunnoksella. Bioinformatics. 2009;25:1754–1760. doi: 10.1093/bioinformatics/btp324. [ DOI ] [ PMC-vapaasti saatavilla oleva artikkeli ] [ PubMed ] [ Google Scholar ]
41.Broad Instituten GitHub-arkisto. Picard Toolkit. [(luettu 11. joulukuuta 2021)]. Saatavilla verkossa: https://broadinstitute.github.io/picard/
42.Danecek P., Bonfield JK, Liddle J., Marshall J., Ohan V., Pollard MO, Whitwham A., Keane T., McCarthy SA, Davies RM Kaksitoista vuotta SAMtoolsia ja BCFtoolsia. Gigascience. 2021;10:giab008. doi: 10.1093/gigascience/giab008. [ DOI ] [ PMC-vapaasti saatavilla oleva artikkeli ] [ PubMed ] [ Google Scholar ]
43.Okonechnikov K., Conesa A., García-Alcalde F. Qualimap 2: Edistynyt moniotoslaatukontrolli suuren läpimenon sekvensointidatalle. Bioinformatics. 2016;32:292–294. doi: 10.1093/bioinformatics/btv566. [ DOI ] [ PMC-vapaasti saatavilla oleva artikkeli ] [ PubMed ] [ Google Scholar ]
44.Van der Auwera G., O'Connor BD Genomiikka pilvessä: Dockerin, GATK:n ja WDL:n käyttö Terrassa. 1. painos. O'Reilly Media, Inc.; Sebastopol, CA, USA: 2020. [ Google Scholar ]
45.Franke KR, Crowgey EL Seuraavan sukupolven sekvensointidata-analyysin nopeuttaminen: Optimoitujen parhaiden käytäntöjen arviointi genomianalyysityökalupakin algoritmeille. Genom. Inform. 2020;18:e10. doi: 10.5808/GI.2020.18.1.e10. [ DOI ] [ PMC-vapaasti saatavilla oleva artikkeli ] [ PubMed ] [ Google Scholar ]
46.Manichaikul A., Mychaleckyj JC, Rich SS, Daly K., Sale M., Chen WM. Vankan suhteen päättely genominlaajuisissa assosiaatiotutkimuksissa. Bioinformatics. 2010;26:2867–2873. doi: 10.1093/bioinformatics/btq559. [ DOI ] [ PMC-vapaasti saatavilla oleva artikkeli ] [ PubMed ] [ Google Scholar ]
47.R-ydintiimi. R: Kieli ja ympäristö tilastolliselle laskennalle. R Foundation for Statistical Computing; Wien, Itävalta: 2024. [ Google Scholar ]
48.Nerkowski SA, Hohenlohe PA, Rachlow JL, Warheit KI, Gallie JA, Waits LP Pitkäaikainen noninvasiivinen geneettinen seuranta ohjaa uhanalaisten Columbia-alueen pygmykaniinien (Brachylagus idahoensis) geenien palautumista. 2025; 16:956. doi: 10.3390/genes16080956. [ DOI ] [ PMC : n ilmainen artikkeli ] [ PubMed ] [ Google Scholar ]
49.Sharma BB, Mustafa M., Sharma T., Dev Banerjee B., Urfi AJ Mikrosatelliittimerkkiaineiden lajienvälinen monistus Mycteria leucocephala Pennant 1769: Sulaneet höyhenet onnistuneena DNA-lähteenä. Indian J. Exp. Biol. 2014;52:1011–1016. [ PubMed ] [ Google Scholar ]
50.Aslam M., Naeem F., Seher R., Shabbir MZ, Shehzad W., Imran M. Säilytyslämpötilan ja -ajan vaikutus erilaisten höyhentyyppien ja DBS-matriisien suoraan PCR-amplifikaatioon. Gene. 2023;854:147116. doi: 10.1016/j.gene.2022.147116. [ DOI ] [ PubMed ] [ Google Scholar ]
51.Schweizer TM, DeSaix MG Kustannustehokas kirjastovalmistelu koko genomin sekvensointiin höyhen-DNA:lla. Conserv. Genet. Resour. 2023;15:21–28. doi: 10.1007/s12686-023-01299-2. [ DOI ] [ Google Scholar ]
52.Ottestad AL, Emdal EF, Grønberg BH, Halvorsen TO, Dai HY FFPE-DNA:n fragmentoitumisarviointi auttaa NGS-kirjaston monimutkaisuuden arvioinnissa ja NGS-tulosten tulkinnassa. Exp. Mol. Pathol. 2022;126:104771. doi: 10.1016/j.yexmp.2022.104771. [ DOI ] [ PubMed ] [ Google Scholar ]
53.Uyaguari-Diaz MI, Slobodan JR, Nesbitt MJ, Croxen MA, Isaac-Renton J., Prystajecky NA, Tang P. Automaattinen geelikoon valinta ympäristövesinäytteistä valmistettujen seuraavan sukupolven sekvensointikirjastojen laadun parantamiseksi. JoVE J. 2015;2015:e52685. doi: 10.3791/52685. [ DOI ] [ PMC-vapaasti saatavilla oleva artikkeli ] [ PubMed ] [ Google Scholar ]
54.Dong CN, Yang YD, Li SJ, Yang YR, Zhang XJ, Fang XD, Yan JW, Cong B. Koko genomin nukleosomisekvensointi tunnistaa uudenlaisia rikosteknisiä markkereita hajotetuissa DNA-näytteissä. Sci. Rep. 2016;6:26101. doi: 10.1038/srep26101. [ DOI ] [ PMC-vapaa artikkeli ] [ PubMed ] [ Google Scholar ]
55.Kim HM, Jeon S., Chung O., Jun JH, Kim HS, Blazyte A., Lee HY, Yu Y., Cho YS, Bolser DM ym. Seitsemän lyhytlukuisen sekvensointialustan vertaileva analyysi käyttäen korealaista referenssigenomia: MGI:n ja Illuminan sekvensointivertailuanalyysi koko genomin sekvensoinnille. Gigascience. 2021;10:giab014. doi: 10.1093/gigascience/giab014. [ DOI ] [ PMC-vapaasti saatavilla oleva artikkeli ] [ PubMed ] [ Google Scholar ]
56.Lingham-Soliar T., Bonser RHC, Wesley-Smith J. Keratiinimatriisin selektiivinen biohajoaminen höyhenrachisissa paljastaa klassisen biotekniikan. Proc. R. Soc. B. 2010;277:1161–1168. doi: 10.1098/rspb.2009.1980. [ DOI ] [ PMC-vapaasti saatavilla oleva artikkeli ] [ PubMed ] [ Google Scholar ]
57.Kishikawa T., Momozawa Y., Ozeki T., Mushiroda T., Inohara H., Kamatani Y., Kubo M., Okada Y. Empirical Evaluation of Variant Calling Accuracy using Ultra-Deep Whole-Genome Sequencing Data. Sci. tasavalta 2019;9:1784. doi: 10.1038/s41598-018-38346-0. [ DOI ] [ PMC : n ilmainen artikkeli ] [ PubMed ] [ Google Scholar ]
58.Gassmann M., Ruefer A., Liu M., Salowsky R. Formaliiniin kiinnitettyjen, parafiiniin upotettujen ja tuorepakastettujen kudosten DNA:n laadunvalvonta ennen kohdennettua rikastusta ja seuraavan sukupolven sekvensointia. J. Biomol. Tech. 2012;23:S35. [ Google Scholar ]
59.Jansson L., Fagerholm SA, Börkén E., Hedén Gynnå A., Sidstedt M., Forsberg C., Ansell R., Hedman J., Tillmar A. Assessment of DNA Quality for Whole Genome Library Preparation. Anaali. Biochem. 2024;695:115636. doi: 10.1016/j.ab.2024.115636. [ DOI ] [ PubMed ] [ Google Scholar ]
60.Koetsier G., Cantor E. Käytännön opas nukleiinihappojen konsentraation ja puhtauden analysointiin mikrotilavuusspektrofotometreillä. [(luettu 8. joulukuuta 2025)]. Saatavilla verkossa: https://www.covaris.com/wp-content/uploads/M020131.pdf .
61.Versmessen N., Van Simaey L., Negash AA, Vandekerckhove M., Hulpiau P., Vaneechoutte M., Cools P. DeNovixin, NanoDropin ja Qubitin vertailu DNA:n kvantifioinnissa ja epäpuhtauksien havaitsemisessa bakteeri-DNA-uutteissa. PLoS ONE. 2024;19:e0305650. doi: 10.1371/journal.pone.0305650. [ DOI ] [ PMC-vapaasti saatavilla oleva artikkeli ] [ PubMed ] [ Google Scholar ]
